摘要：簡(jiǎn)單的說(shuō)，PCR*是利用DNA聚合酶對(duì)特定基因做體外或試管內(nèi)InVitro的大量合成，基本上它是利用DNA聚合酶進(jìn)行專一性的連鎖復(fù)制。目前常用的技術(shù)，可以將一段基因復(fù)制為原來(lái)的一百億至一千億倍。根據(jù)DNA擴(kuò)增的目的和檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)，可以將PCR儀分為普通PCR儀，梯度PCR儀，原位PCR儀，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀四類。

PCR簡(jiǎn)介

PCR的要素

基本的PCR須具備

1.要被復(fù)制的DNA模板 Template

2.界定復(fù)制范圍兩端的引物Primers.

3.DNA聚合酶Taq. Polymearse

4.合成的原料(四種脫氧核苷酸)及水。

PCR儀工作原理

利用升溫使DNA變性，用限制性內(nèi)切酶使DNA雙鏈解鏈，在聚合酶的作用下使單鏈復(fù)制成雙鏈，進(jìn)而達(dá)到基因復(fù)制的目的

PCR的反應(yīng)包括三個(gè)主要步驟

分別是1. Denaturation 2. Annealing of primers,3. Extension of primers。 所謂 Denaturing乃是將DNA加熱(至90~95℃)變性， 將雙股的DNA加熱后轉(zhuǎn)為單股DNA以做為復(fù)制的模板. 而Annealing 則是令 Primers于一定的溫度下(冷卻至55~60℃)附著于模板DNA兩端。 *后在DNA聚合酶e.g. Taq-polymerase 的作用下(加熱至70~75℃)進(jìn)行引物的延長(zhǎng) Extension of primers及另一股的合成。

PCR的*早設(shè)想核酸研究已有100多年的歷史，本世紀(jì)60年代末、70年代初人們致力于研究基因的體外分離技術(shù)，Korana于1971年*早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想：“經(jīng)過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因”。

PCR的實(shí)現(xiàn)

1985年美國(guó)PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis 等發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的聚合酶鏈反應(yīng)。其原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制

PCR的改進(jìn)與完善

Mullis*初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺點(diǎn)是：

①Klenow酶不耐高溫， 90℃會(huì)變性失活，每次循環(huán)都要重新加。

②引物鏈延伸反應(yīng)在37℃下進(jìn)行，容易發(fā)生模板和引物之間的堿基錯(cuò)配，其PCR產(chǎn)物特異性較差，合成的DNA片段不均一。此種以Klenow酶催化的PCR技術(shù)雖較傳統(tǒng)的基因擴(kuò)增具備許多突出的優(yōu)點(diǎn)，但由于Klenow酶不耐熱，在DNA模板進(jìn)行熱變性時(shí)，會(huì)導(dǎo)致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)周期，給PCR技術(shù)操作程序添了不少困難。這使得PCR技術(shù)在一段時(shí)間內(nèi)沒能引起生物學(xué)界的足夠重視。

1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶進(jìn)行PCR，其擴(kuò)增的DNA片段很均一，真實(shí)性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。

1988年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌thermus aquaticus 中提取到一種耐熱DNA聚合酶。此酶具有以下特點(diǎn)：

①耐高溫，在70℃下反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來(lái)的90%，在93℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來(lái)的60%，在95℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來(lái)的40%。

②在熱變性時(shí)不會(huì)被鈍化，不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶。

③大大提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效率，增加了擴(kuò)增長(zhǎng)度2.0Kb。由于提高了擴(kuò)增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多聚酶IKlenow片段區(qū)別，將此酶命名為TaqDNA多聚酶Taq DNAPolymerase。此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR廣泛的被應(yīng)用。

PCR儀的分類

普通的PCR儀

把一次PCR擴(kuò)增只能運(yùn)行一個(gè)特定退火溫度的PCR儀，叫傳統(tǒng)的PCR儀，也叫普通PCR儀。如果要做不同的退火溫度需要多次運(yùn)行。主要是做簡(jiǎn)單的，對(duì)目的基因退火溫度的擴(kuò)增。該儀器主要應(yīng)用于科研研究，教學(xué)，學(xué)臨床，檢驗(yàn)檢疫等機(jī)構(gòu)。

梯度PCR儀

把一次性PCR擴(kuò)增可以設(shè)置一系列不同的退火溫度條件(溫度梯度)，通常有12種溫度梯度，這樣的儀器*叫梯度PCR儀。因?yàn)楸粩U(kuò)增的不同DNA片段，其*適退火溫度事不同，通過設(shè)置一系列的梯度退火溫度進(jìn)行擴(kuò)增，從而一次性PCR擴(kuò)增，*可以篩選出表達(dá)量高的*適退火溫度，進(jìn)行有效的擴(kuò)增。主要用于研究未知DNA退火溫度的擴(kuò)增，這樣節(jié)約成本的同時(shí)也節(jié)約了時(shí)間。主要用于科研，教學(xué)機(jī)構(gòu)。梯度PCR儀，在不設(shè)置梯度的情況下也可以做普通PCR擴(kuò)增。

原位PCR儀

用于從細(xì)胞內(nèi)靶DNA的定位分析的細(xì)胞內(nèi)基因擴(kuò)增儀，如病源基因在細(xì)胞的位置或目的基因在細(xì)胞內(nèi)的作用位置等。是保持細(xì)胞或組織的完整性，使PCR反應(yīng)體系滲透到組織和細(xì)胞中，在細(xì)胞的靶DNA所在的位置上進(jìn)行基因擴(kuò)增，不但可以檢測(cè)到靶DNA，又能標(biāo)出靶序列在細(xì)胞內(nèi)的位置，于分子和細(xì)胞水平上研究疾病的發(fā)病機(jī)理和臨床過程及病理的轉(zhuǎn)變有重大的實(shí)用價(jià)值。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀

在普通PCR儀的基礎(chǔ)上增加一個(gè)熒光信號(hào)采集系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)，*成了熒光定量PCR儀。其PCR擴(kuò)增原理和普通PCR儀擴(kuò)增原理相同，只是PCR擴(kuò)增時(shí)加入的引物是利用同位素、熒光素等進(jìn)行標(biāo)記，使用引物和熒光探針同時(shí)與模板特異性結(jié)合擴(kuò)增。擴(kuò)增的結(jié)果通過熒光信號(hào)采集系統(tǒng)實(shí)時(shí)采集信號(hào)連接輸送到計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)得出量化的實(shí)時(shí)結(jié)果輸出。把這PCR儀叫做實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(qPCR儀)。熒光定量PCR儀有單通道，雙通道，和多通道。當(dāng)只用一種熒光探針標(biāo)記的時(shí)候，選用單通道，有多熒光標(biāo)記的時(shí)候用多通道。單通道也可以檢測(cè)多熒光的標(biāo)記的目的基因表達(dá)產(chǎn)物，因?yàn)橐淮沃荒軝z測(cè)一種目的基因的擴(kuò)增量，需多次擴(kuò)增才能檢測(cè)完不同的目的基因片段的量。該儀器主要用于學(xué)臨床檢測(cè)，生物藥研發(fā)，食品行業(yè)，科研院校等機(jī)構(gòu)。

獲得諾貝爾獎(jiǎng)的PCR技術(shù)

1995年，美國(guó)科學(xué)家Mulis眾望所歸地獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，他所取得的成*是發(fā)明了PCR技術(shù)。

PCR，中文譯為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其實(shí)是一種DNA的快速擴(kuò)增技術(shù)，其擴(kuò)增效率之高*象核裂變的“鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”那樣。PCR技術(shù)通過兩個(gè)短的稱為引物的 DNA小片段和一種耐熱的酶的作用，可以在3個(gè)小時(shí)內(nèi)把特定的DNA量提高1000萬(wàn)倍。這種技術(shù)一問世，立刻引起了分子生物學(xué)研究的一場(chǎng)革命，人們利用 這種轟動(dòng)全的技術(shù)很快*把微觀領(lǐng)域的生物學(xué)研究大大地往前推了一步?？梢赃@么說(shuō)，PCR技術(shù)使分子生物學(xué)研究一下子獲得了突破，而且隨著PCR技術(shù)的 日趨完善，PCR在人類社會(huì)生活中的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛。比如說(shuō)在“DNA指紋” 中我們提到，科學(xué)家們只需要一根頭發(fā)甚至一個(gè)細(xì)胞*可以完成DNA指紋的鑒定工作，這里實(shí)際上*要采用PCR技術(shù)，因?yàn)橐粋€(gè)細(xì)胞中的DNA含量實(shí)在太少 了，人們根本不可能檢測(cè)到它的指紋;有了PCR技術(shù)*好辦了，通過PCR技術(shù)把這個(gè)細(xì)胞中的DNA片斷擴(kuò)增1000萬(wàn)倍，這樣DNA量*足夠作指紋鑒定了。 再比如，在院里檢驗(yàn)血液中的某種病毒，有時(shí)病毒量極少(例如有的艾滋病病毒攜帶者)，通過傳統(tǒng)的檢查方法費(fèi)力又費(fèi)時(shí)，這時(shí)PCR技術(shù)也許*可以幫上忙。 可以先選定這種病毒DNA上的一段DNA，設(shè)計(jì)合適的引物DNA，然后通過PCR技術(shù)一擴(kuò)增很快*可以判斷出血樣中是否擴(kuò)增出了大量的DNA，如果是的 話，那么*說(shuō)明血樣中帶有該種病毒了。PCR方法不但有極高的靈敏度，而且可以同時(shí)一次做近百個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)，省時(shí)省力效率高。

PCR技術(shù)神奇*神奇在以下幾個(gè)特點(diǎn)上：一是被擴(kuò)增的DNA所需量極小，理論上講一個(gè)分子*可以用于擴(kuò)增了;二是擴(kuò) 增效率高，目的基因的量成指數(shù)形式擴(kuò)增，幾個(gè)小時(shí)*擴(kuò)增1000萬(wàn)倍以上?，F(xiàn)在PCR技術(shù)已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)研究、食品衛(wèi)生、療、法及環(huán)境監(jiān) 測(cè)等諸多方面，真不愧是“獲得諾貝爾獎(jiǎng)”的好技術(shù)!

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