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微生物測定的發(fā)展

來源:愛儀器儀表網(wǎng)  發(fā)布時間:15-03-18 16:25  作者:ai1718  瀏覽次數(shù):860  分類:技術(shù)文章

微生物生長情況可以通過測定單位時間里微生物數(shù)量或生物量(biomass)的變化來評價。通過微生物生長的測定可以客觀地評價培養(yǎng)條件、營養(yǎng)物質(zhì)等對微生物生長的影響,或評價不同的抗菌物質(zhì)對微生物產(chǎn)生抑制(或殺死)作用的效果,或客觀地反映微生物生長的規(guī)律。因此微生物生長的測量在理論上和實踐上有著重要的意義。微生物生長的測定有計數(shù)、重量和生理指標(biāo)等方法。


1、計數(shù)法
此法通常用來測定樣品中所含細(xì)菌、孢子、酵母菌等單細(xì)胞微生物的數(shù)量。計數(shù)法又分為直接計數(shù)和間接計數(shù)兩類。

直接計數(shù)
這類方法是利用特定的細(xì)菌計數(shù)板或血細(xì)胞計數(shù)板,在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。此法的缺點不能區(qū)分死菌與活菌。計數(shù)板是一塊特制的載玻片,上面有一個特定的面積lmm2和高0.1mm的計數(shù)室,在1mm2的面積里又被刻劃成25個(或16個)中格,每個中格進一步劃分成16個(或25個)小格,但計數(shù)室都是由400個小格組成。

將稀釋的樣品滴在計數(shù)板上,蓋上蓋玻片,然后在顯微鏡下計算4-5個中格的細(xì)菌數(shù),并求出每個小格所含細(xì)菌的平均數(shù),再按下面公式求出每毫升樣品所含的細(xì)菌數(shù)。

每毫升原液所含細(xì)菌數(shù)=每小格平均細(xì)菌數(shù)×400×l000×稀釋倍數(shù)

 

間接計數(shù)法

又稱活菌計數(shù)法,其原理是每個活細(xì)菌在適宜的培養(yǎng)基和良好的生長條件下可以通過生長形成菌落。將待測樣品經(jīng)一系列10倍稀釋,然后選擇三個稀釋度的菌液,分別取0.2ml無菌平皿,再倒入適量的已熔化并冷至45℃左右的培養(yǎng)基,與菌液混勻、冷卻、待凝固后,放人適宜溫度的培養(yǎng)箱或溫室培養(yǎng),長出菌落后,計數(shù),按下面公式計算出原菌液的含菌數(shù):

每毫升原菌液活菌數(shù)=同一稀釋度三個以上重復(fù)平皿菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×5 


此法可因操作不熟練造成污染,或因培養(yǎng)基溫度過高損傷細(xì)胞等原因造成結(jié)果不穩(wěn)定。盡管如此,由于該方法能測出樣品中微量的菌數(shù),仍是教學(xué)、科研和生產(chǎn)上常用的一種測定細(xì)菌數(shù)的有效方法。土壤、水、牛奶、食品和其他材料中所含細(xì)菌、酵母、芽孢與孢子等的數(shù)量均可用此法測定。但不適于測定樣品中絲狀體微生物,例如放線菌或絲狀真菌或絲狀藍細(xì)菌等的營養(yǎng)體等。

除上述兩種常用的計數(shù)方法外,還有膜過濾法、比濁法。膜過濾法是當(dāng)樣品中菌數(shù)很低時,可以將一定體積的潮水、海水或飲用水等樣品通過膜過濾器。然后將濾膜干燥、染色,并經(jīng)處理使膜透明,再在顯微鏡下計算膜上(或一定面積中)的細(xì)菌數(shù);比濁法原理是在一定范圍內(nèi),菌的懸液中細(xì)胞濃度與混濁度成正比,即與光密度成正比,菌越多,光密度越大。因此可以借助于分光光度計,在一定波長下,測定菌懸液的光密度,以光密度(optical density,即O..D.)表示菌量。實驗測量時一定要控制在菌濃度與光密度成正比的線性范圍內(nèi),否則不準(zhǔn)確。微生物計數(shù)法,發(fā)展迅速,現(xiàn)有多種多樣的快速、簡易、自動化的儀器和裝置等方法。


2、重量法

此法的原理是根據(jù)每個細(xì)胞有一定的重量而設(shè)計的。它可以用于單細(xì)胞、多細(xì)胞以及絲狀體微生物生長的測定。將一定體積的樣品通過離心或過濾將菌體分離出來,經(jīng)洗滌,再離心后直接稱重,求出濕重,如果是絲狀體微生物,過濾后用濾紙吸去菌絲之間的自由水,再稱重求出濕重。不論是細(xì)菌樣品還是絲狀菌樣品,可以將它們放在已知重量的平皿或燒杯內(nèi),于105℃烘干至恒重,取出放人干燥器內(nèi)冷卻,再稱量,求出微生物干重。

如果要測定固體培養(yǎng)基上生長的放線菌或絲狀真菌,可先加熱至50℃,使瓊脂熔化,過濾得菌絲體,再用50℃的生理鹽水洗滌菌絲,然后按上述方法求出菌絲體的濕重或干重。

除了干重、濕重反映細(xì)胞物質(zhì)重量外,還可以通過測定細(xì)胞中蛋白質(zhì)或DNA的含量反映細(xì)胞物質(zhì)的量。蛋白質(zhì)是細(xì)胞的主要成分,含量也比較穩(wěn)定,其中氮是蛋白質(zhì)的重要組成元素。從一定體積的樣品中分離出細(xì)胞,洗滌后,按凱氏定氮法測出總氮量。蛋白質(zhì)含氮量為16%,細(xì)菌中蛋白質(zhì)含量占細(xì)菌因形物的50%一80%,一般以65%為代表,有些細(xì)菌則只占13%一14%,這種變化是由菌齡和培養(yǎng)條件不同所產(chǎn)生的。因此總含氮量與蛋白質(zhì)總量之間的關(guān)系可按下列公式計算:


蛋白質(zhì)總量=含氮量×6.25

細(xì)胞總量=蛋白質(zhì)總量÷(50%~80%(或65%))≈蛋白質(zhì)總量×1.54


核酸DNA是微生物的重要遺傳物質(zhì),每個細(xì)菌的DNA含量相當(dāng)恒定,平均為8.4×10-5ng.因此從一定體積的細(xì)菌懸液中所含的細(xì)菌中提取DNA,求得DNA含量,再計算出這一定體積的細(xì)菌懸液所含的細(xì)菌總數(shù)。


3、生理指標(biāo)法

對于一些非真溶液的樣品,要測定微生物數(shù)量除了用活菌計數(shù)法外,還可以用生理指標(biāo)測定法進行測定。生理指標(biāo)包括微生物的呼吸強度、耗氧量、酶活性、生物熱等。這是根據(jù)微生物在生長過程中伴隨出現(xiàn)的這些指標(biāo),樣品中微生物數(shù)量多或生長旺盛,這些指標(biāo)愈明顯,因此可以借助特定的儀器如瓦勃氏呼吸儀、微量量熱計等設(shè)備來測定相應(yīng)的指標(biāo)。這類測定方法主要用于科學(xué)研究,分析微生物生理活性等。

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